Durante sus estudios en Alcalá, murieron sus padres. Juan fue ordenado sacerdote en 1526, y quiso venerar la memoria de sus padres celebrando su Primera Misa en Almodóvar del Campo. La ceremonia estuvo adornada por la presencia de doce pobres que comieron luego a su mesa. Después vendió todos los bienes que le habían dejado sus padres, los repartió a los pobres, y se dedicó enteramente a la evangelización, empezando por su mismo pueblo.
Un año después, se ofreció como misionero al nuevo obispo de Tlascala (Nueva España), Fr. Julián Garcés, que habría de marchar para América en 1527 desde el puerto de Sevilla. Con este firme propósito de ser evangelizador del Nuevo Mundo, se trasladó san Juan de Ávila a Sevilla, donde mientras tanto se entregó de lleno al ministerio, en compañía de su compañero de estudios en Alcalá el venerable Fernando de Contreras. Ambos vivían pobremente, entregados a una vida de oración y sacrificio, asistencia a los pobres, de enseñanza del catecismo.
Esta amistad y convivencia con Fernando de Contreras, fueron posiblemente las que motivaron el cambio de las ansias misioneras de Juan de Ávila. El P. Contreras habló con el arzobispo de Sevilla, D. Alonso Manrique, y éste le ordenó a Juan que se quedara en las ‘Indias’ del mediodía español. El mismo arzobispo quiso conocer personalmente la valía del nuevo sacerdote y le mandó predicar en su presencia. Juan de Ávila contaría después la vergüenza que tuvo que pasar; orando la noche anterior ante el crucifijo, pidió al Señor que, por la vergüenza que él pasó desnudo en la cruz, le ayudara a pasar aquel rato amargo. Y cuando, al terminar el sermón, le colmaron de alabanzas, respondió: <<Eso mismo me decía el demonio al subir al púlpito.
Durante algún tiempo continuó el ministerio juntamente con Fernando de Contreras. Pronto se dirigió a predicar y ejercer el ministerio en Écija (Sevilla). Uno de sus primeros discípulos y compañero fue Pedro Fernández de Córdoba, cuya hermana de catorce años, D.ª Sancha Carrillo (ambos hijos de los señores de Guadalcázar, Córdoba), comenzó una vida de perfección bajo la guía del Maestro Ávila. La que habría sido dama de la emperatriz Isabel, pasó a ser (después de confesarse con san Juan de Ávila) una de las almas más delicadas de la época y destinataria de las enseñanzas del Maestro en el Audi, Filia, preciosa pieza espiritual del siglo XVI y único libro escrito por Juan de Ávila. Su predicación se extendía también a Jerez de la Frontera, Palma del Río, Alcalá de Guadaira, Utrera..., juntamente con la labor de confesionario, dirección de almas, arreglo de enemistades.
Pero su presencia en Écija pronto le va a acarrear las enemistades y la persecución. El primer incidente ocurrió cuando un comisario de bulas impidió la predicación de Juan para poder predicar él la bula de que era comisario. El auditorio, sin embargo, dejó al bulero solo en la iglesia principal y fue a escuchar a Juan de Ávila en otra iglesia. Después del suceso, el comisario de bulas, en plena calle, propinó una bofetada a Juan. Éste se arrodilló y dijo humildemente: <<emparéjeme esta otra mejilla, que más merezco por mis pecados>>. Este hecho y las envidias de algunos eclesiásticos, llevaron precisamente a los clérigos a denunciar a San Juan de Ávila ante la Inquisición sevillana en 1531.