El día de la Asunción del año 1583, en el momento de recibir la sagrada comunión en la iglesia de los padres jesuitas, de Madrid, oyó claramente una voz que le decía: «Luis, ingresa en la Compañía de Jesús.»
Primero, comunicó sus proyectos a su madre, quien los aprobó en seguida, pero en cuanto ésta los participó a su esposo, este montó en cólera a tal extremo, que amenazó con ordenar que azotaran a su hijo hasta que recuperase el sentido común. A la desilusión de ver frustrados sus sueños sobre la carrera militar de Luis, se agregaba en la mente de Ferrante la sospecha de que la decisión de su hijo era parte de un plan urdido por los cortesanos para obligarle a retirarse del juego en el que había perdido grandes cantidades de dinero.
De todas maneras, Ferrante persistía en su negativa hasta que, por mediación de algunos de sus amigos, accedió de mala gana a dar consentimiento provisional. La temprana muerte del infante Don Diego vino entonces a librar a los hermanos Gonzaga de sus obligaciones cortesanas y, luego de una estancia de dos años en España, regresaron a Italia en julio de 1584.
Al llegar a Castiglione se reanudaron las discusiones sobre el futuro de Luis y éste encontró obstáculos a su vocación, no sólo en la tenaz negativa de su padre, sino en la oposición de la mayoría de sus parientes, incluso el duque de Mántua. Acudieron a parlamentar eminentes personajes eclesiásticos y laicos que recurrieron a las promesas y las amenazas a fin de disuadir al muchacho, pero no lo consiguieron.
Ferrante hizo los preparativos para enviarle a visitar todas las cortes del norte de Italia y, terminada esta gira, encomendó a Luis una serie de tareas importantes, con la esperanza de despertar en él nuevas ambiciones que le hicieran olvidar sus propósitos. Pero no hubo nada que pudiese doblegar la voluntad de Luis. Luego de haber dado y retirado su consentimiento muchas veces, Ferrante capituló por fin, al recibir el consentimiento imperial para la transferencia de los derechos de sucesión a Rodolfo y escribió al padre Claudio Aquaviva, general de los jesuitas, diciéndole: «Os envío lo que más amo en el mundo, un hijo en el cual toda la familia tenía puestas sus esperanzas.»