Inmediatamente después, Luis partió hacia Roma y, el 25 de noviembre de 1585, ingresó al noviciado en la casa de la Compañía de Jesús, en Sant'Andrea. Acababa, de cumplir los dieciocho años. Al tomar posesión de su pequeña celda, exclamó espontáneamente: "Este es mi descanso para siempre; aquí habitaré, pues así lo he deseado" (Salmo cxxxi-14). Sus austeridades, sus ayunos, sus vigilias habían arruinado ya su salud hasta el extremo de que había estado a punto de perder la vida.
Sus maestros habían de vigilarlo estrechamente para impedir que se excediera en las mortificaciones. Al principio, el joven tuvo que sufrir otra prueba cruel: las alegrías espirituales que el amor de Dios y las bellezas de la religión le habían proporcionado desde su más tierna infancia, desaparecieron.
Seis semanas después murió Don Fernante. Desde el momento en que su hijo Luis abandonó el hogar para ingresar en la Compañía de Jesús, había transformado completamente su manera de vivir. El sacrificio de Luis había sido un rayo de luz para el anciano
No hay mucho más que decir sobre San Luis durante los dos años siguientes, fuera de que, en todo momento, dio pruebas de ser un novicio modelo. Al quedar bajo las reglas de la disciplina, estaba obligado a participar en los recreos, a comer más y a distraer su mente. Además, por motivo de su salud delicada, se le prohibió orar o meditar fuera de las horas fijadas para ello: Luis obedeció, pero tuvo que librar una recia lucha consigo mismo para resistir el impulso a fijar su mente en las cosas celestiales.
Por consideración a su precaria salud, fue trasladado de Milán para que completase en Roma sus estudios teológicos. Sólo Dios sabe de qué artificios se valió para que le permitieran ocupar un cubículo estrecho y oscuro, debajo de la escalera y con una claraboya en el techo, sin otros muebles que un camastro, una silla y un estante para los libros.
Luis suplicaba que se le permitiera trabajar en la cocina, lavar los platos y ocuparse en las tareas más serviles. Cierto día, hallándose en Milán, en el curso de sus plegarias matutinas, le fue revelado que no le quedaba mucho tiempo por vivir. Aquel anuncio le llenó de júbilo y apartó aún más su corazón de las cosas de este mundo.
Durante esa época, con frecuencia en las aulas y en el claustro se le veía arrobado en la contemplación; algunas veces, en el comedor y durante el recreo caía en éxtasis. Los atributos de Dios eran los temas de meditación favoritos del santo y, al considerarlos, parecía impotente para dominar la alegría desbordante que le embargaba.